La Puglia è una delle quattro regioni del Sud Italia che produce la maggior quantità di olio extravergine di oliva. Molte cultivar sono presenti sul territorio; esse sono sottoposte a differenze microclimatiche, pedoclimatiche ed ecologiche che contribuiscono a dare all'olio extravergine di oliva differenti proprietà organolettiche e nutrizionali. Questo progetto desidera introdurre, per la prima volta, nell'ambito della caratterizzazione degli oli extravergini di oliva delle aree sopraelencate , l'identificazione del prodotto mediante l'uso della risonanza magnetica nucleare (RMN) acquisendo spettri 1D 1H and 13C and 2D 1H Jres e rapportarlo ad una serie di altri dati quali l'identificazione genetica della cultivar di provenienza, i maggiori micronutrienti che sono presenti nel terreno, le capacita organolettiche e le proprietà nutrizionali del prodotto. Le cultivar individuate per la produzione dell'olio sono quattro scelte tra le più rappresentative della produzione pugliese: Coratina, Ogliarola Barese, Cima di Mola, Peranzana. Il progetto e articolato in 8 obiettivi realizzativi specifici:OR1. Raccolta e collezionamento di rami giovani delle cultivar individuate per l'estrazione del DNA e lo studio genetico delle piante. Raccolta dei campioni di terreno dove gli alberi di olivo sono allocati, secondo un protocollo specifico, per l'analisi di alcuni elementi (carbone organico, azoto totale, carbonati totali, fosforo disponibile, cationi scambiabili, metalli pesanti) e micronutrienti (Zn, Fe, Mn, Cu).OR2. Raccolta e collezionamento delle olive con successiva produzione dell'olio extravergine di olivamonovarietale mediante l'uso di un micromolitore da laboratorio. Analisi spettrometrica di 1350 campioni di olio mediante RMN Bruker 500 e 400 MHz ottenuti da 15 aree geografiche localizzate nelle province di Bari e Foggia. Saranno utilizzati due differenti spettrometri (Bruker Avance DRX 500 MHz e BrukerAvance III 400 MHz) per la validazione dei pattern ottenuti da 450 campioni. L'elevato numero di campioni e dovuto alla necessita di considerare almeno 30 campioni per ogni data-set significativo ed alla raccolta delle olive che sarà effettuata per tre volte nell'arco dei 3 anni.OR3. Analisi merceologica e panel test dei campioni di olio di oliva monovarietali. Correlazioni dei risultati con i dati presenti nel database ed identificazione delle componenti di RMN che partecipano alle proprietà organolettiche.OR4. Influenza delle variabilità climatiche (fattori microclimatici e pedoclimatici) sarà studiata analizzando con RMN gli oli ottenuti dalle 3 raccolte di olive e prodotti in laboratorio nell'arco dei 3 anni per la durata del progetto.OR5. L'attività anti-ossidante sarà valutata in vitro su colture di epatociti e di cellule endoteliali. L'attività anti-infiammatoria sarà valutata in cellule endoteliali umane in coltura sotto opportuni stimoli proinfiammatori nonchè in topi C57B6/J in cui e stato indotto uno stato infiammatorio cronico a livello intestinale mediante la somministrazione di destano sodio solfato.OR6. Certificazione degli oli di oliva extravergini monovarietali mediante il protocollo dell'Azienda Oliveti Terra di Bari.OR7. Confronto dell'olio extravergine di oliva monovarietale con le DOP mediante la valutazione della presenza di elementi in tracce con l'uso dello spettrometro di massa ed i dati della RMN presenti nel database.OR8. Costituzione e sviluppo di un database specifico che conterrà tutti i dati ottenuti dai precedenti OR in cui sono stati analizzati 1350 campioni di olio extravergine di oliva monovarietale. Questo database sarà utilizzato per migliorare la tracciabilità del prodotto regionale impiegato per la produzione dell'olio.

Il cancro del colon-retto è una delle più comuni neoplasie nei paesi occidentali ed industrializzati con 500.000 nuovi casi diagnosticati ogni anno nel mondo. Nonostante i continui progressi che sono stati fatti nella diagnosi e nella terapia di questa neoplasia la prognosi è severa per una buona parte dei pazienti affetti da questa neoplasia anche dopo i trattamenti chemioterapici. Tuttavia il cancro del colon rimane un modello di studio per quel che riguarda la definizione delle basi genetiche e biologiche di inizio e progressione della neoplasia. I numerosi studi, che si sono accumulati negli ultimi 20, anni hanno chiarito come le cellule del colon acquisiscano la capacità di proliferare in maniera incontrollata essenzialmente attraverso due vie alternative che differiscono nei geni oncosoppressori ed oncogeni che possono essere inattivati o attivati. Inoltre queste due vie differiscono per le caratteristiche molecolari esibite dai tumori nei quali la cancerogenesi si è instaurata attraverso l’una o l’altra via. I tumori del colon-retto presentano sempre un’instabilità genomica che però può essere di due tipi: cromosomica o dei microsatelliti. Mentre nel primo tipo c’è la presenza nelle cellule tumorali di un cariotipo anomalo sia nel numero che nella struttura dei cromosomi, nel secondo tipo c’è l’accumulo di inserzioni e/o delezioni di 1-2 nucleotidi in sequenze ripetute che possono trovarsi sia in regioni codificanti che non codificanti.Questa caratteristica molecolare viene anche definita fenotipo mutatore (MIN o MSI) o RER (Replication ERror). Il fenotipo mutatore è caratteristico dei tumori di pazienti affetti da cancro del colon ereditario non poliposico (HNPCC) nonché del 5-15% delle neoplasie colorettali sporadiche. Con questo progetto si vuole realizzare un nuovo kit basato sull’amplificazione contemporanea di cinque loci microsatelliti BAT25, BAT26, D5S346, D17S250 e D2S123. Saranno selezionate cinque coppie di primer che saranno utilizzate per una multiplex PCR su DNA estratto da tessuto normale e patologico dello stesso paziente. Gli amplificati dei cinque loci devono avere grandezza differente per poter essere separati mediante analisi elettroforetica su gel di acrilammide. I possibili risultati di questa analisi sono: • il fenotipo MSI-H (High), caratterizzato dalla presenza di instabilità in almeno due dei cinque loci amplificati con successo; • il fenotipo MSI-L (Low), caratterizzato dalla presenza di instabilità in almeno uno dei cinque loci amplificati con successo; • il fenotipo MSS, caratterizzato dall’assenza di instabilità nei cinque loci amplificati con successo. A questa analisi sarà aggiunta la possibilità di dosare la proteina hMLH1 o hMLH2, assente nel 95% dei tumori con instabilità, mediante metodica ELISA. La semplicità della metodica e la standardizzazione della stessa ne rendono possibile l’impiego anche in laboratori dove le attrezzature di biologia molecolare sono limitate. Gli scopi del seguente progetto sono: 1. validare il kit su un lotto di campioni di tumori colorettali ed altre neoplasie come il carcinoma renale; 2. allestire diversi lotti del kit per verificare la consistenza e la riproducibilità tra lotti del kit da noi sviluppato; 3. includere nel kit una metodica ELISA per la determinazione della presenza/assenza di proteine hMLH1 e hMSH2 che sono responsabili del 90% dei casi di instabilità dei microsatelliti. Punti di forza del progetto sono: 1. evidenziare l’eventuale presenza di differenti valutazioni dipendenti dai lotti allestiti; 2. applicare il kit per la valutazione di un altro tumore come il carcinoma renale; 3. evidenziare la presenza o l’assenza di due proteine che potrebbero essere marcatori prognostici importanti ai fini della prognosi del paziente; 4. disponibilità per il laboratorio di biologia molecolare di un kit che non è solo diagnostico ma anche prognostico.

Il progetto desidera raggiungere i seguenti 3 obiettivi: 1) Costituzione di una Banca di cellule staminali adulte renali (CS), brevettazione delle linee cellulari, confezionamento ed immissione sul mercato. 2) Allestimento di un kit basato sulla fluorescenza in fase solida (FISA) e richiesta di brevetto. 3) Costruzione di un bioreattore per emodialisi renale da mettere a disposizione delle aziende interessate nel campo specifico. Richiesta di brevetto. Il progetto svolto da 5 UR e 2 aziende, si articola in 4 workpackages. WP1. Isolamento di CS adulte da reni umani. La procedura, già consolidata nell’ambito dell’UR1, permetterà l’isolamento delle cellule CD133+ che saranno poste in cultura in specifico terreno contenente fattori di crescita (EGF e PDGF-BB) per la proliferazione.(UR1) WP2. Caratterizzazione delle CS adulte renali. Il WP comprende 6 fasi che vedono il coinvolgimento dell’UR1, UR2, UR3, UR4 e dell’Azienda ApuliaBiotech. La prima fase include la valutazione delle caratteristiche fenotipiche delle cellule utilizzando in citofluorimetria differenti antisieri per lo studio degli antigeni di membrana (CD133, 44, 105, cKit, CD24, 34 e 45). Lo studio deve dimostrare che le cellule sono effettivamente staminali e/o progenitrici in modo da escludere una possibile origine emopoietica. La seconda fase valuta le caratteristiche clonogeniche delle cellule in coltura. Si otterranno in tal modo singoli cloni cellulari CD 133+. La terza fase studia le capacità differenziative sia in senso renale (cellule epiteliali ed endoteliali) che extrarenale (adipociti, neuroni). La quarta fase valuta il profilo di espressione genica delle CS confrontato con altri tipi di CS non renali utilizzando microarray che contengono 47000 geni probe sets. La quinta fase include la caratterizzazione proteomica delle CS che si articola attraverso l’uso di differenti metodiche: 1) screening rapido dei lisati proteici ottenuti dalle linee cellulari mediante SELDI-TOF-MS; 2)analisi mediante elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE); 3) identificazione e sequenziamento degli spots proteici mediante MALDI-TOF-MS e nano HPLC-ESI-MS/MS. Inoltre in questa fase si realizzerà lo sviluppo di un kit basato sulla fluorescenza in fase solida (FISA) per l’identificazione di CS sia in fase liquida (culture in vitro) che solida (tessuti, biopsie renali). La sesta fase è rivolta all’analisi dell’espressione delle acquaporine nelle CS. La loro identificazione, effettuata mediante l’analisi di RT-PCR, permetterà una caratterizzazione sia delle CS indifferenziate che differenziate in direzione renale ai fini di un loro utilizzo per la realizzazione di un bioreattore per emodialisi.(UR1, 2 e 3) WP3.Allestimento delle Banca di cellule staminali adulte renali ed analisi di mercato. Il WP, svolto dall’UR4 e dall’ApuliaBiotech, è dedicato al collezionamento delle CS isolate dall’UR1 e caratterizzate dall’UR1, UR2 e UR3. Sarà analizzato e realizzato l’intero processo di banking che inizia con il deposito delle CS e termina con la consegna al destinatario. I passaggi dal premaster al master e quindi alla distribuzione prevederà un certo numero di test per il controllo di qualità e le prove di sicurezza. L’analisi di mercato sarà svolta attraverso le seguenti fasi: 1)valutazione dello stato dell’arte della tecnologia oggetto di trasferimento ed analisi di benchmarking; 2)valutazione del mercato di riferimento; 3)identificazione di potenziali utenti finali; 4)definizione di piani di sfruttamento commerciale. Dopo l’analisi di mercato si procederà al confezionamento, packaging, brevettazione ed immissione sul mercato, anche con ε-commerce.(UR4, 1) WP4. Costruzione di un bioreattore per emodialisi. Il WP, svolto dall’UR5 e dall’Azienda Extrasolution srl, si articola in 4 fasi: 1) Caratterizzazione di base di composti organici per la nanofabbricazione, e del flusso fluidica all’interno di microcanali; 2) Litografia soft per il patterning di cellule staminali adulte renali differenziate con la fabbricazione di strutture master ed il trasferimento del pattern a CS differenziate; 3) Progettazione e fabbricazione di componenti funzionali fluidici; 4) Piattaforma di implementazione del chip.(UR5, 1) Il progetto propone, per la prima volta nel mondo, la realizzazione di una banca di linee cellulari staminali adulte renali che potrà permettere una notevole incentivazione agli studi rivolti verso la cura delle malattie renali. La costruzione di un kit di proteomica servirà per lo studio non solo dei processi di differenziamento delle CS ma anche per la loro identificazione in vitro ed in vivo nel tessuto patologico. Infine viene proposto per la prima volta, un bioreattore per emodialisi basato su un concetto rivoluzionario che è quello di un circuito integrato microfluidico. Le imprese saranno coinvolte con le seguenti modalità: ApuliaBiotech fornirà la sua esperienza nell’allestimento della Banca di cellule staminali adulte renali e nel loro confezionamento. Extrasolution sarà responsabile di una vasta gamma di caratterizzazioni superficiali e di volume sui materiali polimerici impiegati. Al termine del progetto si costituiranno 2 aziende spin-off di cui la prima gestirà la Banca delle cellule staminali e la seconda il bioreattore per emodialisi. Il progetto prevede l’attivazione di 9 borse di studio di cui 1 per sabbatical internazionale. Il piano della formazione specialistica sarà rivolto a borsisti, dottorandi, assegnisti e giovani ricercatori che partecipano al progetto con la frequenza di moduli. La formazione sarà prevalentemente pratica e si svolgerà nei laboratori dei Dipartimenti dell’Università di Bari, di Foggia, dell’Istituto Nazionale di Fisica della Materia, Consiglio Nazionale delle Ricerche, sede di Lecce e l’Istituto Superiore Universitario di Formazione interdisciplinare (ISUFI) di Lecce.

Nel 2008 la Regione Puglia con l'avviso pubblico "Invito alla presentazione di proposte progettuali relative alla costituzione di reti di laboratori pubblici di ricerca", pubblicato nel BUR Puglia n.41 del 13.03.2008, destinava al settore della ricerca pubblica regionale 28,5 Meuro di risorse FAS. Successivamente, con l'aggiunta di altri 20 Meuro di risorse FSE il budget raggiungeva la somma di circa 50 Meuro.In tal modo,la Regione Puglia si poneva nell'ambito della valorizzazione del Sistema della Ricerca. Il progetto ONEV desidera come, primo obiettivo, realizzare una rete che comprende le reti di laboratori pubblici con un comune denominatore (BISIMANE, LAIFF, BIOPOP, LABERPAR, TEGUVA, NABIDIT) ,riconosciute dalla Regione Puglia, ovvero l'impiego delle piattaforme high throughput per l'uso delle omiche (genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica) nella diagnostica delle malattie che colpiscono l'uomo, gli animali e le piante. Il secondo obiettivo è quello di individuare nuovi biomarkers diagnostici che possono essere utilizzati per la realizzazione di chip prototipali, di cui una delle reti di laboratori (NABIDIT) svolge principalmente questa attività di ricerca. Infine, questa rete delle reti, mediante il potenziamento infrastrutturale ed un programma formativo di aggiornamento, desidera realizzare una ricerca trasversale che permetta l'utilizzazione di nuove molecole, provenienti dal mondo animale e vegetale, per la cura delle malattie che oggi principalmente colpiscono la società umana come le neoplasie e le malattie metaboliche (diabete).L'esigenza di potenziamento delle strutture di ricerca e dei laboratori per un valore di 27 Meuro, consistenti in ammodernamento e adeguamento edilizio ed impiantistico e nella richiesta di ulteriori attrezzature scientifiche e tecnologiche, è basata sulle necessità specifiche di realizzare la rete delle reti che amplierà le attività come mostrano gli studi di mercato e i piani industriali, di sviluppo e di internazionalizzazione presentati nel progetto. La struttura organizzativa della rete (piano di sviluppo) sarà articolata su due livelli: realizzazione del Consorzio di scopo (ONEV) e realizzazione di società spin-off. Essa permetterà il processo di internazionalizzazione e consoliderà le relazioni già esistenti con altri partner attuali.I servizi offerti riguarderanno i settori della red-biotech (patologie neoplastiche, renali e metaboliche), green biotech (cultivar ed alimenti, valorizzazione e miglioramento delle produzioni zootecniche) e nanobiotech (sviluppo di chip per analisi molecolari, nano vettori intelligenti per il trasporto ed il rilascio controllato da alcuni farmaci). Attualmente la rete fornisce il service delle piattaforme omiche ad alcuni paesi dell'Europa dell'Est e dell'area mediterranea. I volumi di vendita attuali e quelli ipotizzati genereranno un risultato economico sostenibile positivo a partire dal secondo anno di attività del Consorzio. Lo sviluppo del progetto di potenziamento per poter accrescere la qualità del partenariato e superare lo "skill shortage" del personale svilupperà un programma di formazione, in collaborazione con l'Istituto Superiore di Sanità e con il Centro di Competenza CERTA, per manager della ricerca, operatore tecnico-commerciale per il settore scientifico e di figure esperte nella gestione di GMP facility, nelle buone pratiche di laboratorio e nelle piattaforme omiche e nano biotecnologie.In conclusione, il progetto ONEV coinvolgerà laboratori regionali ed interregionali delle regioni della convergenza. Nel perseguire le linee strategiche della Regione Puglia, darà con l'uso delle omiche un grande contributo al sistema innovativo della ricerca migliorando le relazioni efficaci tra sistema istituzionale pubblico, scientifico e produttivo industriale