Abstract

Il cancro del colon-retto è una delle più comuni neoplasie nei paesi occidentali ed industrializzati con 500.000 nuovi casi diagnosticati ogni anno nel mondo. Nonostante i continui progressi che sono stati fatti nella diagnosi e nella terapia di questa neoplasia la prognosi è severa per una buona parte dei pazienti affetti da questa neoplasia anche dopo i trattamenti chemioterapici. Tuttavia il cancro del colon rimane un modello di studio per quel che riguarda la definizione delle basi genetiche e biologiche di inizio e progressione della neoplasia. I numerosi studi, che si sono accumulati negli ultimi 20, anni hanno chiarito come le cellule del colon acquisiscano la capacità di proliferare in maniera incontrollata essenzialmente attraverso due vie alternative che differiscono nei geni oncosoppressori ed oncogeni che possono essere inattivati o attivati. Inoltre queste due vie differiscono per le caratteristiche molecolari esibite dai tumori nei quali la cancerogenesi si è instaurata attraverso l’una o l’altra via. I tumori del colon-retto presentano sempre un’instabilità genomica che però può essere di due tipi: cromosomica o dei microsatelliti. Mentre nel primo tipo c’è la presenza nelle cellule tumorali di un cariotipo anomalo sia nel numero che nella struttura dei cromosomi, nel secondo tipo c’è l’accumulo di inserzioni e/o delezioni di 1-2 nucleotidi in sequenze ripetute che possono trovarsi sia in regioni codificanti che non codificanti.Questa caratteristica molecolare viene anche definita fenotipo mutatore (MIN o MSI) o RER (Replication ERror). Il fenotipo mutatore è caratteristico dei tumori di pazienti affetti da cancro del colon ereditario non poliposico (HNPCC) nonché del 5-15% delle neoplasie colorettali sporadiche. Con questo progetto si vuole realizzare un nuovo kit basato sull’amplificazione contemporanea di cinque loci microsatelliti BAT25, BAT26, D5S346, D17S250 e D2S123. Saranno selezionate cinque coppie di primer che saranno utilizzate per una multiplex PCR su DNA estratto da tessuto normale e patologico dello stesso paziente. Gli amplificati dei cinque loci devono avere grandezza differente per poter essere separati mediante analisi elettroforetica su gel di acrilammide. I possibili risultati di questa analisi sono: • il fenotipo MSI-H (High), caratterizzato dalla presenza di instabilità in almeno due dei cinque loci amplificati con successo; • il fenotipo MSI-L (Low), caratterizzato dalla presenza di instabilità in almeno uno dei cinque loci amplificati con successo; • il fenotipo MSS, caratterizzato dall’assenza di instabilità nei cinque loci amplificati con successo. A questa analisi sarà aggiunta la possibilità di dosare la proteina hMLH1 o hMLH2, assente nel 95% dei tumori con instabilità, mediante metodica ELISA. La semplicità della metodica e la standardizzazione della stessa ne rendono possibile l’impiego anche in laboratori dove le attrezzature di biologia molecolare sono limitate. Gli scopi del seguente progetto sono: 1. validare il kit su un lotto di campioni di tumori colorettali ed altre neoplasie come il carcinoma renale; 2. allestire diversi lotti del kit per verificare la consistenza e la riproducibilità tra lotti del kit da noi sviluppato; 3. includere nel kit una metodica ELISA per la determinazione della presenza/assenza di proteine hMLH1 e hMSH2 che sono responsabili del 90% dei casi di instabilità dei microsatelliti. Punti di forza del progetto sono: 1. evidenziare l’eventuale presenza di differenti valutazioni dipendenti dai lotti allestiti; 2. applicare il kit per la valutazione di un altro tumore come il carcinoma renale; 3. evidenziare la presenza o l’assenza di due proteine che potrebbero essere marcatori prognostici importanti ai fini della prognosi del paziente; 4. disponibilità per il laboratorio di biologia molecolare di un kit che non è solo diagnostico ma anche prognostico.