Abstract

L'obiettivo della proposta è l'individuazione di accessioni di O. europaea resistenti (o tolleranti) al patogeno X. fastidiosa, da individuarsi nell'ambito del germoplasma olivicolo del Salento. L'attività prevede cinque workpackage (WP) principali: WP1. Monitoraggio delle superfici olivetate delle Province di Lecce e Brindisi. Tale azione sarà svolta con particolare riferimento alle aree territoriali presumibilmente colpite dalla batteriosi da tempi più remoti (vedi Gallipoli e comuni limitrofi). L'attività è finalizzata alla ricerca di accessioni di olivo asintomatici e/o con ridotta presenza di sintomi di disseccamento che abbiano vissuto più stagioni vegetative in territori compromessi dalla presenza della malattia. In tali soggetti, perciò, il cui quadro sintomatologico non sarebbe potenzialmente imputabile allo sviluppo erratico del patogeno e/o ad una alternanza dei sintomi, tipica delle fasi iniziali dell'evento infettivo, ma potrebbe rappresentare un effettivo indizio di tolleranza o resistenza. Le attività di monitoraggio saranno condotte nella zona infetta e saranno attuate con la collaborazione di esperti agronomi e tecnici individuati dal Soggetto Promotore, interessando i seguenti comuni della Provincia di Lecce e Brindisi. Inoltre, sempre di concerto con esperti agronomi e tecnici con comprovata conoscenza del territorio, sarà predisposta una azione di contatto con gli olivicoltori al fine di raccogliere indicazioni relative ad accessioni di interesse, finalizzate ad ulteriori azioni di monitoraggio e campionamento mirate. A seguito dell'individuazione di soggetti di interesse, questi saranno oggetto di una attività di catalogazione finalizzata a registrarne: • posizione geografica (georeferenziazione) • scala patometrica • descrizione del soggetto, con particolare riferimento a eventuali altre fitopatologie • immagini Le accessioni saranno oggetto di campionamento di materiale fogliare e legnoso in osservanza delle orme vigenti, con successivo trasferimento presso il laboratorio di Patologia Vegetale del DiSTeBA. In tale sede, i campioni biologici saranno oggetto di analisi diagnostica mediante real time PCR al fine di accertarne lo stato sanitario e quantificare lo stato infettivo. Analogo processo interesserà almeno un soggetto limitrofo a quello indagato (fenotipicamente analogo o, se assente, rappresentativo dell'area di coltivazione), in modo tale da accertare le condizioni fitosanitarie del sito e procedere ad eventuali comparazioni. WP2. Studio delle alterazioni metaboliche e modifiche istologiche coinvolte nei meccanismi di resistenza. L'invasione ed il consolidamento di X. fastidiosa all'interno di olivo dipendono dalla capacità del batterio di muoversi efficacemente tra i vasi xilematici e di colonizzare sistemicamente l'ospite. Tale abilità è contrastata nella varietà resistenti, nelle quali è contenuta la diffusione e la proliferazione del batterio nei tessuti. Questa azione progettuale prevede l'indagine dei meccanismi che sottintendono tale azione di contrasto, indagando le alterazioni metaboliche a carico dei processi di formazione del legno. L'obiettivo è quello di determinare differenze istologiche ed anatomiche a carico del tessuto xilematico (siano esse costitutive od indotte da infezione) nelle accessioni selezionale a seguito del WPl, e comprendere come queste possano influenzare la suscettibilità a X. fastidiosa, con particolare riferimento alla produzione da parte della pianta di composti che modulano la morfologia dello xilema, creando barriere fisiche che limitano la fase esplorativa del batterio, come l'accumulo di pectine, lignine e gomme. Attraverso l'impiego di microscopi elettronici a scansione/fluorescenza saranno condotte indagini anatomiche (lunghezza, diametro, distribuzione e connettività dei vasi xilematici) e istochimiche (colorazioni specifiche per determinare la natura chimica dei componenti vascolari) su cultivar suscettibili/resistenti, definendone i profili metabolici (es. accumulo di composti coinvolti nell'alterazione dello xilema come precursori della lignina). WP3. Studio dei processi di colonizzaziorìe in accessioni resistenti. Le accessioni oggetto dello screening saranno inoltre processate mediante analisi FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) che utilizza sonde marcate disegnate su specifiche regioni del DNA batterico. L'analisi, altamente innovativa, rappresenta una combinazione di approcci molecolari abbinati alla microscopia che ottimizza l'esplorazione degli habitat microbici e permette l'osservazione dell'interazione ospite/patogeno in situ. Grazie alla specificità di riconoscimento del batterio nei tessuti, la FISH può rappresentare anche una efficiente tecnica di microscopia diagnostica utile per azioni di early detection del patogeno. L'identificazione diretta mediante FISH consentirebbe la visualizzazione con riconoscimento diretto e specifico del patogeno, oltre ad una valutazione quantitativa del grado di colonizzazione del tessuto infetto, attraverso l'impiego di tecniche di imaging associate ad analisi statistica dedicata, particolarmente utile per comprendere i processi di colonizzazione in piante potenzialmente resistenti o tolleranti. WP4. Riconoscimento varietale del germoplasma e caratterizzazione di endofiti. Le accessioni mostranti resistenza o tolleranza verso X. fastidiosa saranno oggetto, insieme ad opportuni controlli suscettibili, di analisi con marcatori molecolari. In particolare, il fmgerprinting sarà condotto utilizzando marcatori SSR riportati in letteratura su olivo (es. DCA 05, OCA 09,DCA17, DCA 18, GAPU 71B, GAPU 101, EMO 90) e/o marcatori SNP basati su tecniche di sequenziamento di nuova generazione (es. GBS). 1 dati molecolari saranno integrati con descrittori morfologici che comprendono caratteri qualitativi (nel caso dell'olivo vi sono la forma della foglia, forma del frutto e dell'endocarpo, etc.), quantitativi (pezzatura della drupa) e biologici (la resistenza della pianta ad agenti patogeni). Infine, in soggetti selezionati, saranno effettuate analisi finalizzate a caratterizzare la presenza di endofiti fungini e batterici mediante procedure di metabarcoding. WP5. Analisi dei dati e relazione finale. I dati collezionati nell'ambito dei WP1-WP4 saranno oggetto di analisi al fine di verificarne l'affidabilità scientifica e saranno oggetto di una relazione finale. Le accessioni selezionate saranno incluse in successivi piani di monitoraggio e ricerca condotti da parte del Soggetto Proponente ed altri Enti interessati.