Abstract

La diagnosi prenatale, utilizzata soprattutto nel monitoraggio delle gravidanze di coppie a rischio per malattie cromosomiche e geniche, si basa sul prelievo dei villi coriali (CVS) o del liquido amniotico. Queste tecniche, per la loro invasività, comportano un rischio di aborto di circa 1-5%. Lo studio delle cellule fetali presenti nel circolo ematico materno ha suscitato molto interesse da parte dei ricercatori per la possibilità di sviluppare una tecnica non invasiva semplice ed affidabile, estremamente interessante non solo per le coppie a rischio, ma anche potenzialmente utilizzabile per lo screening prenatale di tute le gravidanze. Nel sangue materno sono presenti diversi tipi di cellule fetali, come gli eritroblasti nucleati (“nucleated red blood cells”, NRBCs), i linfociti, i progenitori della linea eritroide derivati dalle cellule CD34+ e le cellule del trofoblasto. Le cellule CD34+, così come i linfociti, persistono nel circolo ematico dai sei ai ventisette anni dopo la nascita mentre le cellule del trofoblasto sono raramente evidenziabili nel sangue materno. Le NRBCs sono invece considerate ottimi candidati per lo studio delle cellule fetali, in quanto cellule mononucleate, abbondanti nel primo trimestre di gravidanza, relativamente ben differenziate, con una vita breve nel circolo ematico. Inoltre le NRBCs sintetizzano nei primi mesi di gravidanza l’emoglobina fetale (HbF), pressoché assente nelle corrispettive NRBCs dell’adulto. Alcuni studi hanno dimostrato che le NRBCs fetali sono facilmente identificabili nel circolo materno, utilizzando alcuni parametri morfologici seguiti dall’analisi del DNA mediante PCR fluorescente. I principali limiti di questa tecnica risiedono nella complessità sia della valutazione morfologica che della tecnica di micro-manipolazione, che richiedono tempi prolungati e la disponibilità di un operatore altamente specializzato per selezionare le cellule al microscopio e prelevarle manualmente. Alla fine del processo, questa strategia consente di selezionare circa 60 cellule fetali da un prelievo di 20 ml di sangue materno. E’ stata recentemente sviluppata una nuova tecnica basata su chip microelettronici, in grado di separare e manipolare singole cellule, che utilizza circuiti CMOS (la tecnologia standard di microfabbricazione per i circuiti digitali). Il chip è in grado di generare un campo elettrico programmabile, che consente di creare migliaia di gabbie dielettroforetiche. Le cellule eucariotiche, immerse nel liquido posto al di sopra del chip, vengono racchiuse nelle gabbie e possono essere spostate sotto controllo di un software, manipolando simultaneamente e in parallelo tutte le cellule presenti sul chip. Questo approccio non solo permette di selezionare in maniera fine le cellule di interesse, ma anche di recuperarle dalle singole gabbie emulando, in scala ridotta, alcuni strumenti di laboratorio, come le centrifughe o il sorter. Questo progetto si propone di sviluppare un sistema “lab-on-a-chip”, basato su tecnologie di microfabbricazione in grado di identificare in maniera inequivocabile le NRBCs fetali, selezionarle in base alla loro morfologia e alla specifica produzione di catene globiniche, permettendo poi la successiva analisi sia di eventuali aneuploidie cromosomiche mediante QF-PCR, che di mutazioni geniche con metodiche molecolari convenzionali. Lo sviluppo di questa tecnologia permetterà di facilitare il recupero delle cellule fetali presenti nel circolo materno, riducendo il tempo di selezione e l’errore umano dovuto all’operatore, ma soprattutto di utilizzare per la diagnosi prenatale di routine una metodica non invasiva che eliminerà i rischi di aborto correlati all’uso delle attuali tecniche. Di fatto, tutte le tecniche fino ad ora proposte, basate sull’impiego diagnostico di cellule fetali prelevate dal circolo materno non hanno ancora ottenuto un trasferimento nella pratica clinica, in particolare per i limiti e le difficoltà correlate all’analisi di queste cellule. Tale limite sarà superato dalla sperimentazione e dalle tecnologie sviluppate in questo studio.